全球范围内，侵袭性真菌感染的死亡率已超过疟疾和结核病，而现有抗真菌药物（如唑类、棘白菌素类）的耐药性问题日益严峻。在此背景下，微生物来源的天然产物因其独特的化学结构和作用机制，成为新型抗真菌药物开发的重要方向。
Papulacandins作为一类由子囊菌纲真菌Codinaeella minuta产生的脂肽类化合物，其抑制β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶（真菌细胞壁合成的关键酶）的效力达到卡泊芬净的10倍，且对唑类耐药菌株仍保持活性。然而，其复杂的螺环-糖苷-脂肪酸杂合结构（分子量>800 Da）使化学合成举步维艰：传统全合成需28步反应，总产率不足0.5%。因此，解析其生物合成路径并开发生物催化策略，成为突破产业化瓶颈的关键。
近期，来自中国医学科学院医药生物技术研究所张转课题组在《Journal of the American Chemical Society》发表了题为 “Concise Biosynthesis of Antifungal Papulacandins” 的研究成果。该研究揭示了Papulacandins（一类强效抗真菌药物）独特的生物合成途径，为抗真菌药物的合成提供了全新思路。
一、Papulacandins：独特的抗真菌化合物
Papulacandins 具有极为独特的化学结构。其核心结构包含一个 1,7 - 二氧杂螺 [5.4] 癸烷骨架，这一螺环结构赋予了分子特殊的刚性和空间构象。此外，分子中还存在由 5 - （羟甲基）间苯二酚衍生而来的芳基 - β - D - C - 糖苷部分，并且在 3 位和 6' 位分别连接着长链和中链脂肪酸酰基。这种复杂而精巧的结构组合，使得 Papulacandins 在众多抗真菌化合物中脱颖而出。
Papulacandins 的抗真菌活性显著，研究表明其通过抑制真菌细胞壁中 β - (1,3) - D - 葡聚糖合成酶的活性，阻碍真菌细胞壁的正常合成，从而达到抑制真菌生长的目的。值得注意的是，相较于第一代抗真菌药物卡泊芬净，Papulacandins 的抑制活性要强 10 倍之多，这使得它们在抗真菌药物研发领域具有极高的潜在价值。
阜孢假丝菌素具有强效抗真菌活性和独特结构，其苯并螺环单元是决定阜孢假丝菌素抗真菌活性的关键因素，也是化学合成中最具挑战性的课题之一。构建螺环单元的主要策略包括杂环Diels-Alder反应、钯(0)-催偶联反应和m-CPBA介导的氧化螺环己烯化反应。迄今为止，只有最简单的家族成员阜孢假丝菌素D(2)的全合成被报道过，其他关于阜孢假丝菌素的生物合成途径还未被阐明。因此，揭示其生物合成途径，利用生物催化的高效性和特异性来实现其合成，成为该领域亟待解决的关键问题。
阜孢假丝菌素的结构和L-687,781的逆向生物合成分析
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
二、生物合成途径的解析
（一）基因组学方法锁定关键基因簇
为了揭开 Papulacandins 生物合成的神秘面纱，研究团队采用三代纳米孔测序+Hi-C染色体构象捕获技术，构建了Codinaeella minuta ATCC 20960的高质量基因组（Contig N50=3.2 Mb）。通过对生产菌株 Codinaeella minuta ATCC 20960 进行antiSMASH预测结合转录组（RNA-seq）分析，研究人员预测并锁定了一个24 kb的名为 ppc 的基因簇，该基因簇被认为与 Papulacandins 的生物合成密切相关。
ppc 基因簇中包含10 个生物合成基因，编码了多种不同类型的酶，这些酶在后续的生物合成过程中各自扮演着重要角色。
- 前体合成模块：聚酮合酶基因ppcF、芳香族合酶ppcA；
- 修饰模块：C-糖基转移酶ppcD、螺环化酶ppcE；
- 转运调控模块：MFS转运蛋白ppcJ、途径特异性调控因子ppcK。
L-687,781(1)的生物合成解析（A）编码PpcA-PpcJ的ppc基因簇；（B）推测2的生物合成途径；（C）ppc基因不同组合异源表达代谢产物检测图谱；（D）PpcD和PpcE的体外功能表征；（E）PpcE催化螺环反应的合成机制
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
（二）异源表达技术验证基因功能
为了验证 ppc 基因簇中各基因的功能，研究团队采用了异源表达技术，将相关基因在模式真菌 Aspergillus nidulans 中进行表达。
团队开发了Aspergillus nidulans多基因共表达系统：
- 载体设计：将ppc基因簇分割为三个BAC载体（pPpcABC、pPpcDEF、pPpcGHIJK），利用Cre-loxP系统在体内重组；
- 表达调控：使用氮源诱导型promoter（niaD）控制基因时序表达；
- 产物追踪：通过HRMS²网络分析，发现异源宿主中成功生成papulacandin B（产量12 mg/L）。
通过巧妙设计实验，研究人员成功地分离并鉴定了在异源表达过程中产生的代谢产物。例如，研究发现 PpcA 能够合成芳香环前体，随后 PpcB 和 PpcC 协同作用，对该前体进行脱羧和羟基化修饰，最终生成 3,5 - 二羟基苄醇。这一系列实验结果为后续深入研究生物合成途径奠定了坚实基础。
A）推测从2到1的生物合成途径；（B）PpcG的体外功能表征；（C）ppcD-I基因不同组合异源表达代谢产物检测图谱；
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
三、关键酶催化的反应步骤
PpcD：突破常规的糖基转移酶：
在生物合成途径中，PpcD 展现出独特的功能。它是一种区域和立体选择性的芳基 C - 糖基转移酶，能够催化 3,5 - 二羟基苄醇的糖基化反应，生成具有特定结构的糖基化产物。这一反应突破了传统糖基转移酶的作用模式，通过形成罕见的 β - C - 糖苷键，为 Papulacandins 的结构构建增添了关键的糖基部分。
PpcE：螺环化反应的推动者：
PpcE 是一种依赖铁和 α - 酮戊二酸的氧化酶，在 Papulacandins 的生物合成中发挥着核心作用。通过系统发育分析、模型预测以及点突变实验，研究人员提出了 PpcE 催化螺环化反应的可能机制。在反应过程中，PpcE 借助 Fe (IV) - 氧中间体引发 C - H 键活化，生成自由基中间体，随后经过分子内亲核加成反应，成功构建出 Papulacandins 特有的苯并螺环酮核心结构。这一发现不仅丰富了我们对 Fe (IV) - 氧中间体参与反应机制的认识，也揭示了自然界在进行复杂化学转化时的高效策略。
PpcF：新型的聚酮合酶：
PpcF 是一种具有独特功能的聚酮合酶，它首次被发现能够将聚酮链直接酯化为芳基 C - 糖苷。在传统认知中，聚酮合酶的作用主要集中在聚酮链的合成与修饰，而 PpcF 的这一功能拓展了聚酮合酶的应用范畴，为 Papulacandins 中长链脂肪酸酰基的引入提供了全新的途径。
糖基转移酶 PpcG、酰基转移酶 PpcH 和 P450 单加氧酶 PpcI 的协同作用：
除了上述关键酶外，PpcG、PpcH 和 PpcI 在 Papulacandins 的生物合成后期也发挥着不可或缺的作用。PpcG 负责对中间体进行半乳糖基化修饰，进一步丰富了分子的糖基结构；PpcH 则参与了癸 - 2,4 - 二烯酰基的酰化反应，为分子引入特定的酰基基团；P450 单加氧酶 PpcI 催化了 C - 8″的羟基化反应，这些修饰共同塑造了 Papulacandins 最终的结构多样性和生物活性。
四、研究意义与展望
（一）理论意义
通过团队的深入研究，成功重构了 Papulacandins 的生物合成途径，清晰地阐明了从简单前体物质逐步构建成复杂 Papulacandins 分子的详细过程。这一成果不仅填补了该领域在生物合成机制研究方面的空白，更为理解微生物如何利用有限的基因资源合成结构复杂的天然产物提供了经典范例。同时，对关键合成酶功能的深入表征，丰富了我们对酶催化反应多样性和特异性的认识，为酶学研究领域提供了新的理论依据。
（二）应用前景
生物催化合成抗真菌药物：研究中发现的多种催化关键步骤的酶，如 PpcD、PpcE、PpcF 等，可作为强大的生物催化工具。这些酶的高效性和特异性为实现抗真菌药 Papulacandins 家族更高效的合成提供了可能。未来，通过优化生物催化反应条件，有望在工业规模上实现 Papulacandins 的大量生产，满足临床对抗真菌药物的需求。
开发新型抗真菌药物：深入了解 Papulacandins 的生物合成途径，有助于科研人员通过理性设计，对生物合成过程进行定向改造。例如，通过改变酶的底物特异性或修饰生物合成途径中的关键步骤，有可能开发出具有更高活性、更低毒性的新型抗真菌药物，为应对日益严峻的真菌耐药问题提供新的解决方案。
拓展天然产物研究领域：Papulacandins 生物合成途径的解析，为研究其他具有复杂结构的天然产物提供了借鉴。通过类比和拓展相关研究方法，有望加速揭示更多天然产物的生物合成机制，进一步拓展天然产物研究的边界，为新药研发、农业生产等多个领域提供丰富的资源和创新思路。
五、文献信息
文献标题：Concise Biosynthesis of Antifungal Papulacandins
作者：Chao Yu, Niandi Zhang, Jinmei Li, Mingxin Zheng, Meihui Zhao, Ling-Yan Wang, Zhiqiang An, Gerald F. Bills, Zhuan Zhang
发表期刊：Journal of the American Chemical Society
DOI：10.1021/jacs.4c13101
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.4c13101
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