在天然产物化学的版图中，核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs）因其独特的生物合成路径和多样的药理活性，成为近年来的研究热点。这类化合物广泛分布于细菌、植物和真菌中，其中真菌RiPPs因其复杂的次生代谢网络和独特的生态功能而备受期待。然而，受限于真菌基因调控的复杂性、翻译后修饰酶的难重构性，以及环化机制的未知性，真菌RiPPs的研究长期滞后于细菌和植物体系。
加州大学洛杉矶分校唐奕教授团队近期在《JACS》发表的突破性研究，首次实现了真菌DUF3328酶的体外功能重构，并揭示了其铜依赖的双环化机制。这一成果不仅填补了真菌RiPPs环化研究的理论空白，更为环肽药物的理性设计提供了全新范式。本文将从技术路径、机制解析到应用前景，深度剖析这一里程碑式研究的科学价值。
一、研究背景
（一）真菌 RiPPs 的独特地位与价值
RiPPs 的生物合成起始于核糖体对线性前体肽的合成，随后经历一系列复杂的翻译后修饰，从而形成结构多样的成熟产物。这些修饰往往包括环化、氧化、甲基化等，极大地丰富了 RiPPs 的结构复杂性和功能多样性。
在真菌中，RiPPs 同样扮演着重要角色，参与了真菌的生长、发育、防御等多种生理过程，并且部分真菌 RiPPs 具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，为新型药物的开发提供了潜在的先导化合物。例如，来源于曲霉属的asperipin-2a具有显著的抗线虫活性，而镰刀菌产生的enniatins则表现出广谱抗菌特性。然而，其生物合成基因簇（BGCs）中普遍存在的DUF3328功能域蛋白，因缺乏同源结构信息和体外重构方法，成为解析合成路径的最大障碍。
（二）环化修饰的重要性及研究现状
环化是 RiPPs 常见且关键的翻译后修饰方式之一。细菌中已发现多种环化酶（如LanM家族），其催化机制可通过体外重组清晰解析。通过环化，RiPPs 的线性结构转变为环状，这一改变显著增强了其代谢稳定性，同时优化了与靶标的结合能力，从而提升生物活性。在细菌和植物 RiPPs 中，环化机制的研究已较为深入，多种环化酶及相关反应途径被清晰阐明。然而，真菌 RiPPs 的环化研究却困难重重。真菌RiPPs的环化酶（如DUF3328）存在以下特殊性：
- 底物特异性模糊：无需前导肽引导，直接作用于核心肽段；
- 辅因子依赖复杂：需铜离子、氧气及还原剂的多级协同；
- 催化路径非常规：涉及自由基中间体和多步氧化偶联。
这些特性使得传统酶学手段（如原核表达系统）难以奏效，导致研究长期停滞。
（三）DUF3328 酶的研究困境
在真菌 RiPPs 的生物合成基因簇中，常常包含编码具有未知功能域（DUF3328）的酶基因。以 dikaritin 类 RiPPs 为例，这类在真菌中仅鉴定出 5 种的物质，其生物合成基因簇中就含有编码 DUF3328 蛋白的基因。虽然已知该酶在体内能够催化多种氧化翻译后修饰，对真菌 RiPPs 的氧化成熟至关重要，但此前在体外对其功能的重构始终未能成功。这一障碍严重制约了对真菌 RiPPs 生物合成机制的深入理解，使得真菌 RiPPs 研究长期停滞不前。因此，攻克 DUF3328 酶的体外功能重构难题，成为推动真菌 RiPPs 研究的关键所在。
二、研究内容
（一）技术路径突破
唐奕教授团队将目光聚焦于黄曲霉（Aspergillus flavus）中的 AprY，将其作为解开真菌 RiPPs 环化机制之谜的关键模型酶。AprY 所在的 asperipin - 2a 生物合成基因簇包含前体肽基因 aprA、DUF3328 酶基因 aprY 等，为研究提供了一个完整且具有代表性的体系。
真菌来源dikaritin类RiPPs
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
通过巧妙运用大肠杆菌表达 - 包涵体复性重折叠方法，唐奕团队成功获得了纯化的 AprY 蛋白。这一关键步骤为后续的体外酶反应研究奠定了物质基础。当将纯化的 AprY 蛋白与合成肽段 FYYTGY 在特定条件下混合反应时，令人振奋的结果出现了：在 Cu²⁺存在的情况下，AprY 能够直接催化该六肽发生两种氧化大环化反应。这一发现犹如在黑暗中点亮了一盏明灯，为揭示真菌 RiPPs 的环化机制带来了曙光。
进一步的研究表明，该反应不仅需要氧气和抗坏血酸作为反应条件，更为特殊的是，反应并不依赖前导肽的参与。这一特性打破了以往对 RiPPs 合成机制的传统认知，极大地拓展了对真菌 RiPPs 合成途径的理解范畴，为后续深入研究提供了全新的视角。
AprY催化FYYTGY六肽的大环化反应过程
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
（二）确定催化过程与产物生成路径
为了全面解析 AprY 催化的反应过程，唐奕团队开展了一系列精心设计的实验。通过反应活性测试、时间梯度反应、MS/MS 和 NMR 鉴定等多种先进技术手段的综合运用，成功确定了 AprY 在整个反应过程中的核心催化作用。AprY 负责催化两个大环化反应，生成关键的中间产物，而后续的 AprR 则负责将中间产物 α - 酮基还原为 α - 羟基，最终生成目标产物 asperipin - 2a。
在探究环化机制的过程中，研究团队在 D₂O 中进行酶反应，发现 Tyr3 - Tyr6 间环化可能通过双自由基偶联形成，Phe1 - Tyr3 间环化通过自由基中间体形成。这些细致入微的研究结果，详细描绘了 asperipin - 2a 生物合成过程中关键的大环化步骤，为深入理解真菌 RiPPs 的合成机制提供了极为重要的实验依据。
导的asperipin-2a (2)生物合成途径及AprY催化的环化反应机制
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
（三）深入探究环化机制
为了揭示 AprY 催化大环化的详细机制，唐奕团队运用了 ¹⁸O 标记实验、质谱和同位素标记实验等多种前沿技术。通过 ¹⁸O 标记实验，精确地确定了 asperipin - 2a 中 α - 羟基氧来源于水分子，这一发现为环化机制的解析提供了关键线索。
基于质谱和同位素标记实验结果，唐奕团队提出了 AprY 催化大环化的详细机制：第一步大环化通过两个氢原子抽取步骤生成自由基中间体，再经自由基重组生成单一 C - O 交联产物；第二步大环化，酶可能通过 α - 羰基的氧化 - 脱水序列或自由基消除机制实现酪氨酸 - 苯丙氨酸的连接。这些深入而系统的研究成果，为全面理解真菌 RiPPs 的环化机制提供了坚实的理论支撑，使我们对真菌 RiPPs 生物合成过程的认识上升到了一个新的高度。
通过生物信息学预测，发现 AprY 蛋白结构中含有两个保守的 HXXHC 基序，推测其可形成铜结合中心。为了验证这一预测并深入了解蛋白结构与活性的关系，研究团队进行了点突变实验。实验结果清晰地表明，AprY 的活性严格依赖完整的配位环境和二聚体结构。这一发现深刻揭示了 AprY 蛋白结构与其催化活性之间的紧密内在联系，为进一步调控和利用该酶提供了重要的理论基础，也为后续基于结构的酶工程改造提供了方向。
三、研究亮点与成果意义
该研究的重大意义首先体现在成功实现了真菌 DUF3328 酶的体外重建。在此之前，由于无法在体外重现相关酶的功能，对真菌 RiPPs 的研究受到了极大的限制，许多深入的机制探究无法开展。而如今，体外重建的成功使得科研人员能够在可控的实验条件下，更加深入、细致地研究酶的作用机制，揭示了真菌 RiPPs 的奥秘。
通过系统而深入的研究，团队清晰地揭示了 AprY 铜依赖的大环化机制。这一机制的阐明，极大地丰富了我们对 RiPPs 后修饰酶家族多样性的认识。此前，对于真菌 RiPPs 环化机制的了解极为有限，而此次研究成果填补了这一领域的重要空白。更为重要的是，为挖掘真菌潜在天然产物生物合成途径提供了全新的思路和工具。
从应用前景来看，该研究成果具有广阔的发展空间。未来，这一研究方法有望广泛应用于更多 DUF3328 酶的研究，进一步拓展我们对真菌 RiPPs 的认知边界，发现更多新颖的真菌 RiPPs 及其生物合成途径。更为重要的是，对真菌 RiPPs 大环化机制的深入理解，将为环肽药物的理性设计与合成提供有力的支持。环肽药物因其独特的结构和生物活性，在药物研发领域备受关注。通过借鉴真菌 RiPPs 的大环化机制，科研人员可以更加精准地设计和合成具有特定功能的环肽药物，提高药物研发的效率和成功率。
四、文献信息
文献标题：Fungal RiPPs Side Chain Macrocyclization Catalyzed by Copper-Dependent DUF3328 Enzyme
作者：Chen-Yu Chiang, Masao Ohashi, Yi Tang
发表期刊：Journal of the American Chemical Society
DOI：10.1021/jacs.4c18770
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.4c18770
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