一、研究背景与意义
非核糖体肽（NRPs）在药物研发中占据着重要地位，而环化过程是其生物合成的关键环节。环化能够显著提升 NRPs 的稳定性、生物活性、结合亲和力以及膜通透性，因此，探寻 NRPs 生物合成中具有环化功能的新酶，对于发现新型活性天然产物意义非凡。在众多 NRPs 环化酶里，硫酯酶在催化内酯和内酰胺形成方面扮演着重要角色，像在大分子内酰胺（如 Leinamycin）、β - 内酰胺（如 Sulfazecin）和 γ - 内酰胺（如 Glidomides）的合成中，硫酯酶驱动的内酰胺化反应都起到了至关重要的作用。然而，其在其他内酰胺类化合物合成中的潜力尚未得到充分挖掘，进一步深入研究硫酯酶在这方面的功能和价值，对推动天然产物药物开发进程至关重要。
在生物医药领域，对具有特殊结构和生物活性的天然产物的研究一直是热点。近期，上海交通大学刘天罡教授团队携手武汉大学陶慧教授团队以及复旦大学附属儿科医院王慧君研究员团队，在 Organic Letters 上发表的一项研究成果引起了广泛关注。该研究围绕刺糖多孢菌中 Spinactins 的 δ - 内酰胺形成和去铁活性展开了深入探究，为铁超载疾病的治疗带来了新的希望和思路。
二、研究过程与关键发现
（一）化合物的分离与鉴定
研究团队以刺糖多孢菌 Saccharopolyspora spinosa NRRL18395 为研究对象，从其发酵液中成功分离出一系列非核糖体肽 Spinactins A - E（1 - 5）。其中，B - E 为新发现的结构化合物，这些化合物具有独特的结构特征。其 C 端呈现出 δ - 内酰胺 / 1,4 - 硫氮杂卓双环结构，这种特殊结构可能赋予了化合物独特的化学和生物学性质；N 端则含有 5 - 氨基水杨酸基团，该基团在化合物的活性和功能方面或许也起着重要作用。
硫酯酶SncF催化形成δ-内酰胺结构
为了确定这些化合物的生物合成来源，研究团队运用基因组分析技术，对刺糖多孢菌的基因进行了全面而深入的研究，成功筛选出候选的生物合成基因簇。随后，借助基因敲除和异源表达技术，经过大量的实验和细致的分析，最终确认了负责 Spinactins 合成的 snc 基因簇。这一成果为后续深入研究 Spinactins 的生物合成机制奠定了坚实的基础。
Spinactins A-E（1-5）及其生物合成基因簇的发现与鉴定
（二）生物合成途径的解析
由于 Spinactins 与铁载体 Pyochelin 在结构上具有一定的相似性，研究团队以此为线索，大胆推测了 Spinactins 可能的生物合成途径。考虑到硫酯酶在催化非核糖体肽链释放并形成内酰胺结构方面的能力，研究人员提出假设：Spinactins 中独特的 δ - 内酰胺结构可能是在 II 型硫酯酶 SncF 的催化作用下，于肽链释放过程中形成的。
体外反应解析Spinactins的生物合成途径
为了验证这一假设，研究团队开展了一系列严谨的体外酶促反应实验。他们精心合成了底物 1a 和 1b，并将其与纯化后的 SncF 进行反应。实验结果令人振奋，1b 在 SncF 的催化下成功环化形成了 Spinactin A，这一关键发现确凿地证实了 SncF 能够催化特殊的在线环化反应生成 δ - 内酰胺。在此基础上，研究人员进一步深入研究，表达并纯化了 snc 基因簇中的后修饰酶 SncA、SncC、SncG 和 SncK。以分离得到的化合物 1 - 5 为底物，进行了一系列体外反应，逐步揭示了 Spinactins 的完整生物合成过程。这一研究成果不仅为 Spinactins 的生物合成途径提供了详细的解析，更为非核糖体肽环化机制的研究提供了重要的理论支撑，填补了该领域的部分空白。
此外，研究人员还考察了不同类型的烯烃，如二芳基烯烃、苯乙烯、内烯等。实验结果表明，这些烯烃在该反应体系中也能以中等的产率实现相应的转化。例如，二芳基烯烃在反应中能够发生 C - C 键和 C - O 键的构建，生成具有复杂结构的产物，虽然产率相对三氟甲基烯烃略低，但仍然具有重要的应用价值。
通过对多种底物的系统研究，充分证明了该反应体系具有良好的底物耐受性和广泛的适用性，能够满足不同有机合成需求。
（三）体外活性测试与疾病治疗潜力评估
在完成对 Spinactins 生物合成途径的解析后，研究团队对其体外活性进行了深入研究。化合物 1（Spinactin A）在实验中展现出了极为优异的铁离子结合能力，这一特性使其在铁代谢相关疾病的治疗方面具有潜在的应用价值。更为重要的是，在高达 200 nM 的浓度下，化合物 1 未表现出显著的细胞毒性，这表明其作为一种安全、有效的铁螯合剂具有很大的潜力。
为了进一步评估化合物 1 在治疗铁超载疾病方面的可行性，研究团队在多种细胞模型中进行了测试。在健康细胞及铁超载 HepG2 细胞模型中，化合物 1 表现出色，不仅能够显著减轻细胞内的铁超载现象，而且与已获 FDA 批准的铁螯合剂去铁酮和去铁胺相比，其毒性更低。这一优势使得化合物 1 在治疗铁超载相关的肝脏疾病方面具有很大的优势。
Spinactin A的细胞毒性和去铁功效评估
此外，研究团队还关注到 BPAN 这种罕见的神经退行性疾病，其伴有铁过载的特征。在 BPAN 疾病的 iPS 细胞模型中，研究人员对化合物 1 的去铁效果进行了测试。经过 12 天的给药处理后，实验结果显示细胞内的铁水平显著降低。这一结果充分突显了化合物 1 在 BPAN 治疗中的巨大潜力，为这种目前尚无有效治疗方法的罕见疾病带来了新的曙光。
（四）基于关键酶的拓展研究
鉴于 Spinactins 的优异活性，研究人员以 SncF 作为探针，开展了更为深入的研究。通过生物信息学分析和实验验证，成功鉴定出与 snc 基因簇相似的 NRP 基因簇。有趣的是，SncF 及其同源酶（18310 和 14370）在系统发育分析中并未聚集在非核糖体肽中更常见的 TE16 分支，而是聚集在与聚酮类环状产物形成相关的 II 型硫酯酶 TE18 分支。这一独特的发现表明，SncF 同源蛋白也可能具有催化合成 δ - 内酰胺类铁载体的潜力。这为进一步发现更多具有治疗潜力的 δ - 内酰胺类铁载体提供了新的方向和思路，有望在未来的药物研发中挖掘出更多有效的治疗药物。
SncF及其同源酶的系统发育分析
三、总结与展望
本研究成功地从刺糖多孢菌中鉴定出了特殊铁载体 Spinactins A - E（1 - 5），并深入解析了其生物合成过程中的关键酶。明确了硫酯酶 SncF 在催化 Spinactins 特殊 δ - 内酰胺结构形成中的核心作用，极大地深化了人们对非核糖体肽生物合成中硫酯酶催化环化机制的理解。与传统的铁螯合剂去铁酮和去铁胺相比，Spinactin A 表现出更低的毒性，在铁超载 HepG2 细胞及 BPAN iPS 细胞模型中均能有效恢复细胞活力并显著降低铁含量，显示出其在治疗 BPAN 等铁超载疾病方面的巨大潜力。
然而，尽管目前已经取得了这些重要的研究成果，但仍有许多问题值得进一步深入研究。例如，虽然已经确定了 Spinactins 的生物合成途径和关键酶，但对于整个合成过程中的调控机制仍知之甚少。未来的研究可以聚焦于探究在不同环境条件和细胞生理状态下，如何调控 Spinactins 的合成，以实现更高效的生产。此外，在药物开发方面，虽然 Spinactin A 展现出了良好的治疗潜力，但仍需要进一步开展动物实验和临床试验，以全面评估其在体内的药代动力学、药效学和安全性等方面的特性。同时，对于 SncF 同源蛋白的研究也只是刚刚起步，需要进一步深入挖掘其催化机制和潜在的应用价值，以期发现更多具有创新性的药物靶点和治疗策略。
总之，这项研究为铁超载疾病的治疗药物研发开辟了新的途径，也为非核糖体肽的生物合成研究提供了宝贵的参考。相信在未来的研究中，随着对 Spinactins 及其相关机制的深入理解和探索，将会为生物医药领域带来更多的突破和创新，为患者带来更多的治疗选择和希望。
四、文献信息
文献标题：Deciphering the δ-Lactam Formation and lron-Reducing Activity of Spinactins from Saccharopolyspora spinosa
作者：Zhengning Ma, Zhelan Huang, Yunfei Liao, Jiaqi Mao, Jing Yang, Quan Dai, Ran Liu, Huijun Wang, Hui Tao, Tiangang Liu
发表期刊：Organic Letters
DOI：10.1021/acs.orglett.4c04109
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.orglett.4c04109
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